BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar
Belakang
Dalam budidaya padi di
Indonesia petani umumnya mengalami kendala biologi seperti serangan hama wereng
cokelat (Hanarida & Soewito 1993) dan hama penggerek batang padi (Pathak
& Khan 1994). Menurut Badan Pusat Statistik (2002), dari 112.918 ha area
pertanaman padi di 29 propinsi di Indonesia, menunjukkan adanya intensitas
serangan penggerek batang padi sebesar 39.08%. Perakitan kultivar padi unggul
yang resisten merupakan pilihan yang murah dan efektif untuk pengendalian hama
tersebut. Permasalahan yang dihadapi dalam pengembangan kultivar padi yang
resisten adalah tidak tersedianya plasma nutfah padi, termasuk
varietas-varietas lokal, dengan tingkat ketahanan yang tinggi terhadap hama
tersebut untuk dijadikan sebagai tetua dalam program pemuliaan tanaman.
Oleh karena itu, alternatif teknologi rekayasa genetika untuk
mengembangkan plasma nutfah padi transgenik yang resisten terhadap hama wereng
cokelat dan penggerek batang padi perlu digunakan. Keberhasilan penerapan
rekayasa genetika tanaman sangat bergantung pada kemampuan mengintroduksikan
gen ke dalam sel/jaringan dan untuk meregenerasikan tanaman transgenik dari
sel/jaringan transgenik yang didapat. Dalam hal ini, tersedianya teknik
transformasi genetika untuk mengintroduksikan gen ke dalam sel/jaringan tanaman
dan teknik kultur jaringan untuk meregenerasikan sel/jaringan transgenik
menjadi tanaman transgenik merupakan prasyarat yang harus dipenuhi.
Pengembangan teknik kultur jaringan yang efektif untuk meregenerasikan
sel/jaringan menjadi tanaman perlu dilakukan agar keberhasilan penerapan
rekayasa genetika pada tanaman padi dapat ditingkatkan.
Salah satu teknologi dalam upaya mengembangkan transformasi
genetika diantaranya dengan menggunakan metode penembakan partikel (Particle
bombardment), yaitu teknologi yang menggunakan metode penembakan partikel atau
gen gun. Metode ini sering digunakan untuk mengintroduksikan gen ke
sel/jaringan tanaman monokotil, terutama pada sel/jaringan tanaman padi. DNA
yang melapisi partikel ditembakkan secara langsung ke dalam sel atau jaringan
tanaman (Klein et al.1988). Partikel yang mengandung DNA tersebut menembus
dinding sel dan membran, kemudian DNA berdifusi dan menyebar di dalam sel
secara independen. Metode transformasi dengan penembakan partikel pertama kali
diaplikasikan pada jagung oleh Gordon-Kamm et al. (1990) dan berhasil
mendapatkan jagung transgenik yang fertil.
1.2. Rumusan Masalah
Terdapat beberapa permasalahan yang akan diselesaikan pada bab
selanjutnya:
a. Bagaimanakah
padi varietas Bengawan Solo ?
b. Apa
saja alat dan bahan yang dibutuhkan?
c. Bagaimanakah
metode dalam melakukan teknik particle bombardment ?
d. Apa
saja faktor – faktor keberhasilan teknik particle bombardment ?
1.3. Tujuan
Pembuatan makalah ini
mempunyai beberapa tujuan, diantaranya:
- Untuk
mengetahui deskripsi dari padi varietas Bengawan Solo.
- Untuk
mengetahui alat dan bahan yang dibutuhkan.
- Untuk
mengetahui metode dalam melakukan teknik particle bombardment.
- Untuk mengetahui apa saja faktor – faktor keberhasilan teknik particle bombardment.
BAB 2 PEMBAHASAN
2.1.
Deskripsi
Gambar 1 Tanaman Padi
Padi Bengawan Solo merupakan padi yang
berasal dari tetua IR56/IR8411 yang memiliki ketahanan terhadap hama wereng
biotipe1 dan peka terhadap penyakit bakteri hawar daun. Memiliki potensi hasil
panen 4,5 - 5,0 ton / ha. Padi Bengawan Solo memiliki karakteristik khusus
yaitu umurnya kurang lebih 117 hari, memiliki bentuk tanaman tegak, tinggi
tanaman kl. 92 cm, anakan produktif banyak (kl.15 malai), warna kakinya hijau,
warna batangnya hijau, tidak meliki warna telinga dan lidah daun, daunnya
berwarna hijau dengan posisinya tegak.
Gambar 2 Proses Particle Bombardment
Alternatif teknologi rekayasa genetika
untuk mengembangkan plasma nutfah padi transgenik yang resisten terhadap hama
wereng cokelat dan penggerek batang padi perlu digunakan. Keberhasilan
penerapan rekayasa genetika tanaman sangat bergantung pada kemampuan untuk
mengintroduksikan gen ke dalam sel/jaringan dan untuk meregenerasikan tanaman
transgenik dari sel/jaringan transgenik yang didapat. Penembakan mikroproyektil
(microprojectile bombardment) menggunakan gene gun merupakan teknik
transformasi genetika yang sering digunakan untuk mengintroduksikan gen ke
sel/jaringan tanaman monokotil, terutama pada sel/jaringan tanaman padi.
Fauquet et al. (1996) melaporkan bahwa pada tanaman padi japonica, efisiensi
transformasi menggunakan mikroproyektil mencapai 25%. Partikel emas atau
tungsten yang telah dilapisi DNA dengan konsentrasi tertentu ditembakkan ke
sel/jaringan tanaman padi untuk mengintroduksikan DNA. Teknik bombardment ini
nerupakan teknik yang paling modern dalam transformasi tanaman yaitu dengan
penggunaan metode gene gun atau particle bombardment. Metode transfer gen ini
dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke
sel atau jaringan tanaman. Penggunaan particle bombardment membuka peluang dan
kemungkinan lebih muda dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai
spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya
tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan turfgrass.
2.2.
Alat
dan Bahan
-
Media dasar NB
-
Alkohol 70%
-
Chlorox 20%
-
500 mg/l Lprolin
-
500 mg/l L-glutamin
-
300 mg/l kasein
hidrolisat
-
30 g/l sukrosa
-
3 g/l fitagel
-
2 mg/l 2,4-D.
-
Etanol absolut
-
50 μl air steril
-
1 μg/μl DNA plasmid
-
20 μl spermidin 0.1
M, 50 μl CaCl2 2.5 M
-
Senyawa osmotikum
manitol 30 g/l
-
sorbitol 30 g/l
2.3. Metode Pelaksanaan
Langkah-langkah
Dalam Melakukan Teknik Bombartment :
1.
Isolasi gen yang diinginkan
Benih padi indica
cv. Bengawan Solo disterilkan dengan direndam dalam alkohol 70% selama satu
menit, dalam larutan Chlorox 20% (v/v) selama 30 menit dan dibilas tiga kali
dengan air steril. Setelah benih disterilkan, embrio diisolasi dari benih padi
dan digunakan sebagai eksplan untuk menginduksi pembentukan kalus embriogen.
Induksi kalus embriogen dilakukan dalam media yang terdiri atas media dasar NB
(Chu et al. 1975), unsur mikro dan vitamin dari media dasar B5 (Gamborg &
Shyluk 1981), dengan penambahan 500 mg/l Lprolin, 500 mg/l L-glutamin, 300 mg/l
kasein hidrolisat, 30 g/l sukrosa, 3 g/l fitagel, dan 2 mg/l 2,4-D. Sebelum
disterilkan pada suhu 121 oC selama 20 menit, dan tekanan 1.2 kg/cm2, pH media
diatur hingga 5.8 dengan penambahan NaOH. Kalus embriogen mulai terbentuk 3-4 minggu
setelah penanaman eksplan dalam media. Kalus embriogen yang didapat dipindahkan
pada media induksi yang sama yang masih segar setiap tiga minggu.
2.
Penyiapan partikel emas
Untuk menyiapkan
empat kali penembakan, partikel emas berdiameter 1.0 μm sebanyak 1.4 mg
disterilkan dalam 50 μl etanol absolut dan divorteks selama satu menit. Setelah
disentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan 8300 x g, supernatan dibuang
dan endapan partikel emasnya disuspensikan dalam 50 μl air steril, dikocok
selama 1 menit, dan disentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan 8300 x g.
Pencucian partikel emas dengan cara tersebut dilakukan dua kali lagi dengan
cara yang sama.
3.
Pemasukan DNA plasmid ke partikel emas steril
Partikel emas yang
telah steril disuspensikan dalam 50 μl air steril dan ke dalamnya ditambahkan 1
μg/μl DNA plasmid dan 20 μl spermidin 0.1 M, 50 μl CaCl2 2.5 M, dan divorteks
selama 3 menit. Campuran disentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan 8300
xg. Setelah dipisahkan dari supernatan, partikel emas disuspensikan dalam 60 μl
etanol absolut. Untuk satu kali penembakan, suspensi partikel emas 10 μl dalam
etanol absolut disebarkan ke bagian tengah dari macrocarrier.
4.
Mengembangkan transgenik fungsional termasuk gen yang diinginkan
Kalus embriogen
ditanam selama empat jam sebelum dan 16-20 jam sesudah dilakukan penembakan
mikroproyektil dalam media induksi kalus dengan penambahan senyawa osmotikum
manitol 30 g/l dan sorbitol 30 g/l untuk mengurangi terjadinya kerusakan sel/jaringan.
Kalus diposisikan secara melingkar dengan diameter 2.5 cm di tengah-tengah
media sebagai daerah sasaran dari penembakan mikroproyektil.
5.
Penembakan mikroproyekti/menggabungkan gen yang diinginkan ke dalam plasmid
Prosedur penembakan
mikroproyektil dilakukan sesuai dengan metode baku dari Gene Gun (Biorad,
Biolistic PDS 1000/He). Penembakan dilakukan dalam kondisi vakum sebesar 27
inci air raksa (in Hg), tekanan gas helium untuk percepatan microcarrier
sebesar 1100 psi, jarak tembak enam cm dan satu kali penembakan. Semua bahan
dan perlengkapan yang diperlukan untuk penembakan mikroproyektil disterilkan
dengan direndam dalam etanol 95% selama 10 menit dan dikering-anginkan dalam
laminar. Pada teknik bombardment terdapat tahapan:
-
DNA dibawa oleh
partikel logam emas atau tungsten yang berukuran mikroskopik. Partikel yang
digunakan untuk bombardment biasanya berupa emas karena bersifat inert, padat,
dan tidak beracun dalam sel. Partikel emas lebih aman untuk digunakan karena
tungsten dapat bersifat toksik pada beberapa tanaman.
-
Partikel yang
membawa DNA ditembakkan oleh senapan
(gun) ke dalam jaringan tanaman dan menembus dinding sel untuk masuk ke dalam
nukleus, mitokondria atau kloroplas dan menyatu dengan kromosom DNA inang. DNA
vektor/plasmid membawa sekuen spesifik yang digunakan untuk mengenali lokasi
yang tepat atau yang diinginkan untuk berintegrasi dengan genome.
-
Gen gun dapat
beroperasi melalui 2 cara yaitu dengan pemberian tekanan udara maupun tegangan
voltase yang tinggi.
-
DNA melepaskan diri
dari partikel di dalam sel. Beberapa DNA masuk ke dalam organel target dan
berhasil berintegrasi dengan kromosom DNA inang.
6.
Pengkulturan kalus
Setelah penembakan
mikroproyektil, kalus embriogen tetap dikulturkan pada media induksi kalus
dengan penambahan osmotikum dan diinkubasi dalam kondisi gelap di ruang kultur
bersuhu 26 oC selama 1620 jam. Selanjutnya, kalus dipindahkan ke media induksi
kalus tanpa senyawa osmotikum dan diinkubasi dalam kondisi gelap di ruang
kultur dengan suhu 26 oC selama dua minggu untuk membantu proliferasi kalus.
Kalus yang
berkembang dipindahkan ke media preregenerasi dan diinkubasi dalam kondisi
gelap selama 2 minggu. Media preregenerasi yang digunakan adalah pre-regenerasi
NB (PRNB) [media dasar NB dengan penambahan 2 mg/l 6- Benzylaminopurine (BAP),
1 mg/l α-Naphthalene acetic acid (NAA), dan 5 mg/l ABA] atau media
pre-regenerasi MS (PRMS) [media dasar MS dengan penambahan 2 mg/l BAP, 1 mg/l
NAA, dan 5 mg/l ABA]. Untuk menginduksi pembentukan tunas, kalus yang telah
ditumbuhkan pada media PRNB dipindahkan ke media regenerasi NB (RNB) sedangkan
kalus yang ditumbuhkan dalam media PRMS dipindahkan ke media regenerasi MS
(RMS), masing-masing dengan atau tanpa penambahan spermidin 0.1 mM.
Selanjutnya, semua kultur diinkubasikan dengan penyinaran 1000 lux selama 16
jam sehari dalam ruang kultur bersuhu 26 o C selama empat minggu. Kalus
dipindahkan ke media regenerasi tunas yang masih segar setiap dua minggu hingga
terbentuk tunas.
Untuk menginduksi
pembentukan planlet, tunas diakarkan dalam media pengakaran (media dasar MS,
dengan penambahan sukrosa 30 g/l dan fitagel 0.3% (w/v)) selama dua minggu atau
sampai terbentuk akar. Sebelum dipindahkan ke rumah kaca, dilakukan
aklimatisasi planlet secara bertahap dengan menanam planlet selama satu minggu
dalam tabung reaksi berdiameter 1.5 cm dan tinggi 15 cm yang berisi air 5 ml
dan selama dua minggu dalam bak plastik ukuran 44 x 34 x 15 cm yang berisi
tanah sawah. Planlet yang berhasil bertahan hidup dalam periode aklimatisasi selanjutnya
dipindahkan ke dalam pot plastik dengan volume 10 l yang berisi tanah sawah.
7.
Analisis molekuler tanaman hasil transformasi
Hasil kultur
dianalisis untuk mengetahui hasil ekspresi DNA asing. Teknik analisis untuk
mengetahui ekspresi transgen dilakukan melalui analisis sourthen blotting atau
PCR.
2.4. Pembahasan
-
Faktor-faktor keberhasilan teknik bombardment adalah:
1. Temperatur,
jumlah sel dan kemampuan regenerasi sel atau totipotensi yang digunakan.
Eksplant yang digunakan lebih baik eksplant yang masih memiliki kemampuan
mersitematis, misalnya jaringan embrional dan epikotil.
2. Jumlah DNA yang
menyelubungi partikel logam yang ditransfer ke dalam sel/jaringan.
3. Tipe senapan
yang digunakan, jenis microcarrier, pemberian tekanan helium.
-
Keuntungan penggunaan teknik bombardment yaitu:
1. Gen gun dapat
digunakan pada jangkauan yang lebih luas, misalnya pada tumbuhan dapat
digunakan organ daun. Bakteri atau virus tidak dapat mentransfer gen ke dalam
kloroplas sehingga metode gen gun dapat digunakan untuk memasukkan DNA asing ke
dalam kloroplas.
2. Transformasi
genetik lebih sederhana, cepat, dan memberikan frekuensi hasil transforman yang
lebih tinggi dibandingkan menggunakan Agrobacterium.
Transformasi menggunakan Agrobacterium pada buncis memiliki frekuensi hasil
transformasi rata-rata 0.5-3%, sedangkan menggunakan partikel bombardment yaitu
18%.
-
Keterbatasan transformasi menggunakan partikel bombardment yaitu:
1. Harga alat dan
perlengkapannya cukup mahal
2. Penembusan
partikel ke dalam jaringan cukup dangkal
3. Daerah
penembusan DNA plasmid ke dalam jaringan target cukup luas sehingga DNA yang
ditransfer ke dalam sel acak. Beberapa sel yang tidak mengekspresikan transgen,
akan mati jika ditumbuhkan dalam medium kultur kusus.
4. Seringkali
terjadi penggabungan salinan ganda transgen pada sisi tunggal penyisipan,
penyusunan ulang gen yang menyisip dan penggabungan transgen pada sisi
penyisipan ganda. Salinan ganda dapat menyebabkan hilangnya transgen pada
keturunan berikutnya (Yao dkk., 2006).
5. Salah satu
permasalahan dalam semua metodologi transformasi yang digunakan dan pada
penggunaan partikel bombardment sendiri adalah tidak ada jaminan terekspresinya
transgen oleh tanaman. Epigenetik dan efek posisi, gen silencing, fenomena
supresi dan co-supresi seringkali menginaktifkan transgen (Romano, dkk.,
2003).
-
Hasil penerapan teknik bombardment pada padi Indica cv. Bengawan Solo
Hasil penelitian yang dilakukan
menunjukkan perlakuan penembakan mikroproyektil dalam transformasi genetika
padi hanya berpengaruh terhadap persentase kematian jaringan eksplan saat dua
minggu pertama setelah perlakuan penembakan. Setelah periode dua minggu,
perlakuan penembakan ini sudah tidak berpengaruh terhadap perkembangan eksplan
padi indica cv. Bengawan Solo. Pengaruh negatif dari perlakuan penembakan
mikroproyektil terhadap daya regenerasi tanaman dari eksplan telah dilaporkan
sebelumnya pada tanaman jagung, gandum, dan padi (Kemper et al. 1996; Rubi et
al. 1999; Harwood et al. 2000). Pada berbagai tanaman tersebut, daya regenerasi
tanaman dari eksplan yang diberi perlakuan penembakan mikroproyektil nyata
menurun dibandingkan dengan eksplan tanpa perlakuan penembakan mikroproyektil.
Salah satu faktor penyebab penurunan daya regenerasi tanaman yang terjadi
adalah akibat kerusakan jaringan eksplan setelah perlakuan penembakan
mikroproyektil (Birch & Bower 1994; Chibbar & Kartha 1994).
Setelah periode penyembuhan dari
kerusakan jaringan akibat perlakuan penembakan mikroproyektil dapat dilewati,
perkembangan eksplan lebih dipengaruhi oleh media tumbuh yang digunakan untuk
meregenerasikan tunas dari eksplan. Media RNB dan RMS, dengan atau tanpa
penambahan spermidin mempunyai pengaruh yang sama terhadap proliferasi kalus
dari eksplan dan pembentukan kalus hijau. Tetapi, kedua tipe media mempunyai
kemampuan yang berbeda untuk menginduksi pembentukan tunas dari eksplan kalus
padi indica cv. Bengawan Solo. Media regenerasi tunas dengan komposisi dasar
media MS lebih baik digunakan dibandingkan dengan media regenerasi dengan komposisi
dasar media NB. Berlawanan dengan informasi yang telah ada, dalam percobaan ini
penambahan spermidin ke dalam media regenerasi tanaman tidak memberikan dampak
positif yang diharapkan. Penambahan senyawa spermidin dilaporkan berpengaruh
positif terhadap kemampuan regenerasi tanaman padi (Shoeb et al. 2001) dan
peningkatan produksi kalus serta regenerasi tanaman hijau pada kultur antera
padi (Usman 1999; Purwoko et al. 2001; Yuskianti 2001). Media regenerasi tunas dengan
komposisi dasar media NB (Chu et al. 1975), unsur mikro dan vitamin dari media
dasar B5 (Gamborg & Shyluk 1981)] dilaporkan mampu menginduksi pembentukan
tunas dari eksplan padi japonica yang telah diberi perlakuan penembakan
mikroproyektil (Fauquet et al. 1996; Lee et al. 2003). Dalam media regenerasi
tunas dengan komposisi media dasar NB, efisiensi regenerasi tunas setelah
perlakuan penembakan mikroproyektil yang dilaporkan berkisar antara 8-50%
(Fauquet et al. 1996). Sebaliknya, media regenerasi tunas dengan komposisi
dasar media MS (Murashige & Skoog 1962) juga telah dilaporkan mampu
menginduksi pembentukan tunas dari eksplan padi japonica dan indica yang telah
diberi perlakuan penembakan mikroproyektil (Rubi et al. 1999; Pons et al.
2000). Dalam media regenerasi tunas dengan komposisi dasar media MS, efisiensi
regenerasi tunas setelah perlakuan penembakan mikroproyektil yang dilaporkan
berkisar 20-60% (Rubi et al. 1999). Dalam kegiatan transformasi genetika untuk
mengintroduksikan gen ke sel/jaringan tanaman dan meregenerasikan tanaman
transgenik, tersedianya metode kultur in vitro yang efisien untuk
meregenerasikan tunas dari eksplan menjadi sangat penting. Penggunaan teknik in
vitro yang efisien dalam menginduksi pembentukan tunas dari eksplan untuk
mendukung transformasi genetika akan meningkatkan kemungkinan didapatkannya
tanaman transgenik. Sebaliknya jika efisiensi regenerasi tanamannya rendah,
maka kemungkinan didapatkannya tanaman transgenik hasil transformasi genetika
juga akan menurun. Dalam percobaan ini kondisi transformasi genetika dengan
penembakan mikroproyektil yang tidak berpengaruh negatif terhadap pertumbuhan
dan perkembangan eksplan telah dievaluasi. Media regenerasi tunas dengan
komposisi dasar media MS lebih disarankan untuk meregenerasikan tanaman dari
eksplan padi indica cv. Bengawan Solo yang telah diberi perlakuan penembakan
mikroproyektil.
BAB
3 PENUTUP
3.1
Kesimpulan
Salah satu rekayasa tanaman yakni dengan menggunakan penembakan
particle bombardment. Particle bombardment memiliki beberapa kelebihan serta
kekurangan. Salah satu tanaman yang dapat dilakukan penembakan particle
bombardment yakni tanaman padi.
DAFTAR
PUSTAKA
Besar, B., Bioteknologi, P., Pertanian,
G., Tentara, J., & No, P. (2005). Daya Regenerasi Padi Indica cv . Bengawan Solo dalam Dua Tipe
Media Regenerasi dengan Penembakan Mikroproyektil
Regeneration Capacity of Indica Rice cv . Bengawan Solo in Two Types of Regeneration Media through
Microprojectile Bombardment, 12(4),
157 161.
http://bbpadi.litbang.pertanian.go.id/plasma/rona_setyanamain=disp_padi_unggul.php&noaksesi=Bengawan%20Solo.pdf
(diakses 15 April 2018).
Tidak ada komentar:
Posting Komentar